一、培训大纲内容总结

1. 流式细胞术基础

• 原理：利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性（细胞大小、DNA含量、细胞表面抗原表达等）进行定量、快速、客观、多参数相关的检测。

• 核心技术：单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。

2. 仪器结构与部件

• 组成：主机(Cytometer)、工作站(Workstation)、电源箱(Power Supply)、自动进样器(MCL)

• 核心部件：488nm氩离子空冷激光、流动室(Flow Cell)、鞘液系统、光电倍增管(PMT)、光电二极管

• 检测信号：前向散射光(FS→细胞大小)、侧向散射光(SS→细胞颗粒性)、荧光信号(FL1~FL4)

3. 光学与信号处理

• 分光元件：二向色性长通滤片(DL) + 带通滤片(BP)

• 信号放大：线性放大(散射光)与对数放大(荧光信号)

• A/D转换：脉冲信号→数字通道(Channel)

• 阈值(Discriminator)：免疫标记设FS=100~150；DNA分析设FL3 PEAK=30~40

4. 免疫荧光分析（单标记/双标记/三标记）

• 原理：抗原与荧光抗体结合→形成荧光复合物→流式细胞仪测定荧光量→反映抗原表达情况

• 阴性对照：同型对照(Isotype Control)用于去除非特异性结合

• 颜色补偿：电子方法校正荧光染料光谱叠加造成的误差（如FL2-X%FL1）

• 标本制备：100μl全血+单抗→避光孵育20min→红细胞裂解(Q-Prep/Optilyse C)→上机检测

5. DNA检测与细胞周期分析

• 原理：荧光染料(PI等)与DNA结合→荧光强度与DNA含量成正比

• 周期时相：G0/G1期(2N)、S期(2N~4N)、G2/M期(4N)

• 关键参数：PEAK信号区分粘连细胞(4N vs 2×2N)、阈值FL3 PEAK=30~40

• 分析软件：MultiCycle进行细胞周期拟合分析

6. 质控体系

7. 软件功能

• System II软件模块：Acquisition(采集)、Listmode(存储/重分析)、Multigraph(多图形)、PCX、Color_Tracker、AutoGate、Logical Gate

• 方案建立流程：选参数→建直方图→设分析区域→设门(Gating)→设停止/存储/打印方式→保存方案→调整电压/增益/补偿

8. 操作与维护

• 开机：检查液路、压力(28~32 PSI)、真空(-17~-30 in.Hg)→预热30min→Flow Check校准

• 关机：漂白水清洗→真空管路清洗→酒精消毒样本台→运行XLOFF→关闭电源

• 日常保养：每日清洗、每月清洗鞘液盒、每60天清洗清洁液盒

二、常见问题（附答案）

问题1：流式细胞仪主要检测哪几类信号？分别反映细胞的什么特性？

答案：流式细胞仪检测三类信号：

1. 前向散射光(FS)：反映细胞大小，细胞越大，FS信号越强。

2. 侧向散射光(SS)：反映细胞内部颗粒性和复杂程度，颗粒越多，SS信号越强。

3. 荧光信号(FL1~FL4)：反映细胞表面抗原或内部物质（如DNA）的表达水平，经荧光染料标记后由激光激发产生。

问题2：什么是颜色补偿？为什么要做颜色补偿？请用公式举例说明。

答案：颜色补偿是用电子方法校正荧光染料光谱之间叠加所造成的误差。因为一种荧光染料不只发出单一波长的光，而是发出一定范围波长的光谱，导致相邻荧光通道之间产生干扰。

举例：FITC发射525nm绿光，但同时也会在575nm处有部分发射光进入FL2通道。因此：
真正的FL2 = 实测RD1(FL2) - 干扰的FITC(FL1)

即补偿公式为：FL2 - X% × FL1，其中X%为FITC对FL2通道的干扰比例。

补偿判断标准：补偿完成后，双参数散点图上阳性细胞群应与坐标轴平行，不再呈现对角线分布。

问题3：在免疫荧光分析中，为什么要设置同型对照(Isotype Control)？它起什么作用？

答案：同型对照(Isotype Control)是用来去除非特异性结合的阴性对照。其作用包括：

1. 排除非特异性结合：抗体可能与细胞表面的Fc受体发生非特异性结合，同型对照抗体（与检测抗体相同亚型但无特异性）可评估这种背景结合水平。

2. 设定阴阳性分界：通过同型对照的荧光强度设定阈值（marker线），高于该阈值的信号才被认为是特异性阳性信号。

3. 确保结果特异性：保证检测到的荧光信号确实来自目标抗原-抗体特异性结合，而非背景干扰。

同型对照应与实验抗体具有相同的来源种属、亚型（如IgG1、IgG2a）和荧光标记。

问题4：请描述DNA含量检测的基本原理，以及如何通过PEAK信号区分粘连细胞？

答案：基本原理：利用PI(碘化丙啶)等荧光染料与细胞内DNA分子特异性结合，经488nm激光激发后发出荧光，荧光强度与DNA含量成正比，流式细胞仪通过测定荧光强度推算DNA含量。

区分粘连细胞（去粘连）：DNA分析中，两个G1期细胞（2N+2N）粘连在一起会被误认为一个G2/M期细胞（4N），造成假象。区分方法：

• 积分信号(Integral)：反映总荧光强度，2×2N（粘连）与4N（单个G2期）积分信号相同，无法区分。

• 峰值信号(Peak)：反映荧光脉冲的高度。粘连细胞通过流动室时有两个细胞核，会产生两个峰值或更宽的脉冲，而单个4N细胞只有一个峰值。

因此，利用 RATIO = FL3 PEAK / FL3 LIN（积分） 参数可将粘连细胞与真实4N细胞区分开来，或通过FL3 PEAK vs FL3 LIN双参数散点图设门排除粘连细胞。DNA分析中阈值通常设在FL3 PEAK=30~40。

问题5：XL流式细胞仪开机的标准步骤是什么？开机后需要进行哪些质控检查？

答案：开机步骤：

1. 开机前准备：检查鞘液盒、清洁液盒加满，废液桶倒空。

2. 启动计算机：计算机自动启动流式细胞仪主机。

3. 检查电源箱：确认AIR FILTER、VACUUM FILTER干燥；WATER TRAP液体不超过1/3；VACUUM TRAP不超过1/4。

4. 检查压力表：SYSTEM VACUUM应在-17~-30 in.Hg；SYSTEM PRESSURE应在28~32 PSI（若不在范围，拉出PRESSURE ADJUSTER钮调节后复位）。

5. 预热30分钟，直至提示"Insert Sample Tube"。

开机后质控检查：

1. 光路与流路校准：使用Flow Check荧光微球，检测5000个微球（设FS阈值），记录FS及FL1~FL4的HPCV值，应<2%，并与历史记录比对。

2. PMT电压校准：使用Flow Set微球，检测10000个，检查Mean(Peak) Channel是否与建立的参考值相符，若不符需调整HV。

3. 在QC保养程序中记录所有质控数据。

问题6：流式免疫荧光分析中，全血标本制备的标准流程是什么？裂解红细胞时需要注意哪些关键点？

答案：标准流程（直标法）：

1. 取100μl抗凝全血（EDTA-K3或肝素抗凝）加入12×75mm试管中。

2. 加入适量荧光标记单抗（按抗体说明书用量）。

3. 室温避光孵育20分钟（抗原抗体结合最佳温度为26~27℃，注意避光）。

4. 裂解红细胞：

   • Q-Prep法：直接将试管放入Q-Prep样本台自动处理。

   • Optilyse C法：加500μl Optilyse C→室温避光10min→加500μl PBS→室温避光10min→1500rpm离心5min弃上清→0.5ml PBS悬浮。

5. 上机检测。

关键注意事项：

• 抗凝剂使用EDTA-K3或肝素，标本有凝块则不可检测。

• 孵育全程避光，防止荧光淬灭。

• 红细胞裂解要完全，同时保持靶细胞形态完整。

• 标本浓度控制在10⁶/ml左右。

• 不推荐使用蒸馏水裂解，会破坏细胞形态。

• Optilyse C含固定剂，制备后可在4℃存放84小时内检测；Q-Prep制备标本可存放48小时。

问题7：请列出流式细胞仪常用的质控品种类及其各自的用途。

答案：

问题8：System II软件中建立检测方案(Protocol)的完整步骤是什么？

答案：建立方案步骤：

1. 选择待测参数（Acquisition→Setup Screen→Protocol）：在屏幕右下方选择所需参数（FS、SS、FL1~FL4、AUX参数如FL3 PEAK、RATIO等），可用User Name自定义信号名称（如FL1→FITC）。

2. 建立直方图：将选定的参数拖拽到X轴和Y轴上，构建单参数或双参数直方图。

3. 界定分析区域（Run/Regions）：单击直方图放大，将Region Edit设为CREATE，在屏幕右侧选择区域类型（单参数：Lin；双参数：REC矩形/AMO任意形/QUA十字形）。

4. 设门建立直方图关系（Gating）：选择已定义的分析区域（如A门），拖拽至需要被设门的直方图上方，建立层级关系。

5. 选择数据采集停止方式（Acquisition Control）：时间停止（秒）、体积及最小计数停止、手动停止；选择LISTMODE或HISTGRAM存储方式；选择自动打印ON/OFF。

6. 存储方案：Acquisition→Protocol→Save As，命名保存。

7. 运行待测样本：调整PMT电压(Volts)、增益(Gain)、流速(Flow Rate)、阈值(Discriminator)、颜色补偿。可利用FastSet调整电压，用Fast Comp调整补偿。

8. 覆盖保存更新后的方案：Save As→覆盖原文件。

问题9：细胞周期各时相的DNA含量分别是多少？为什么DNA分析中需要设置标准参照物？

答案：细胞周期各时相DNA含量：

设置标准参照物的原因：
DNA含量检测是一个相对量，而非绝对量。流式细胞仪测定的是荧光强度（通道数），不是直接的DNA绝对质量或摩尔数。仪器状态（激光功率、PMT电压、流动室清洁度等）的波动会影响荧光强度的绝对值。

因此必须使用已知DNA含量的标准细胞（如BECKMANCOULTER公司的INDEX标准品、鸡红细胞（约2.5N）、正常人淋巴细胞（2N）等）作为参照物，将待测样本的荧光通道数与标准品比对，才能准确定义样本的DNA倍体（二倍体/异倍体），并保证不同实验批次、不同仪器之间的结果可比性。

问题10：流式细胞仪日常维护保养包括哪些内容？关机程序有哪些关键步骤？

答案：日常维护保养：

关机程序关键步骤：

1. 完成日常清洗程序（漂白水→双蒸水）。

2. 完成真空管路清洗程序。

3. 用50%漂白水后，再用70%酒精清洗样本台周围，特别注意样本台和样本针探头。

4. 将装有2ml双蒸水的试管放在样本台上。

5. 退出System II软件：

   • DOS方式：在C:\XL>下键入"XLOFF"

   • WIN方式：双击"XLOFF"图标

6. 依次关闭：计算机主机→打印机→电源箱开关。

注意事项：

• 即使每天24小时工作，也至少关机一次。

• 重新启动激光必须在仪器关闭30分钟之后。

• 不能关机的特殊情况除外。